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凝膠層析介質的應用

 

1. 凝膠層析的分離方式

凝膠層析按其分離方式,主要可分為組族分離和分級分離兩大類型。

1.1 組族分離:

組族分離是將樣品中的各組分分成大小不同的兩類分子,然后從低分子量物質中分離出高分子量的物質,或者從高分子量物質中除去低分子量物質的一種分離方法。在這種情況下,高分子量的物質完全被凝膠層析介質所排阻,不能擴散進入凝膠顆粒的內部,而隨洗脫液流出層析床;小分子量物質則可以擴散進入凝膠顆粒內,洗脫體積幾乎相當于床體積。這種被分離物質之間在分配系數上有極為明顯的差別,稱為組分離、組別分離或組族分離。

組族分離常用于生物產品的制備工藝中,如脫鹽,即小分子鹽與生物大分子的分離,或在生物制品的最后階段脫除低分子物質的精制工序等。組族分離,只能將樣品達到粗分離的目的,只有分子量相差懸殊的物質才能得以分離,分子量相差越大,分離效果越好。這種分離方法的應用范圍比較廣泛,如在電泳和離子交換層析前工作液的脫鹽、樣品中緩沖液的替換、蛋白質的脫鹽、核酸制備中酚及無機鹽等小分子的去除等。由于這種操作具有方便易行、設備簡單、蛋白質回收率高且樣品稀釋度低等優點,長期在制備分離中廣泛應用。目前凝膠層析蛋白質脫鹽工藝,幾乎完全替代了透析法。脫鹽工藝中凝膠層析介質的體積通常為樣品體積的4~5倍,流速可達200cm/h左右。

1.2 分級分離:

分級分離是將分子大小相近的物質分開,其分辨率要比組族分離高,但有時洗脫曲線之間會產生洗脫峰的重疊。分級分離常用于物質的分析,如分子量的測定,生物制品在精制時也采用分級分離,即為獲取高活性部分的生物制品,得到純品的精制過程。這種方法要使物質完全分離是比較困難的,受到多種因素的影響。選擇適當的分離介質尤為重要,必須采用孔徑適當、分離范圍與分子大小相適應的凝膠介質。在操作方面,樣品的上樣量較少,僅為床體積的5%~10%,因此這種分離常用于經過濃縮后的樣品。把分離柱加長,可提高分離效果,但會增加床的壓力降,減低流速。

組族分離和分級分離二者不但在應用方面有區別,在操作方面也有所不同。組族分離的上樣量較大,分離容量大,但分辨率低;而分級分離的上樣量少,分離容量小,但分辨率高。但是,這二者之間并沒有截然的區別。除脫鹽及分級分離外,凝膠層析還適用于變性蛋白質的復性及中草藥有效成分提取分離等工藝,也可進行多肽、蛋白質、核酸及其它大分子物質分子量的測定及緩沖液的置換。

2. 凝膠層析介質的選擇

2.1 類型的選擇:

在進行組族分離時,因為被分離物質的分子量差距較大,因此易于選擇凝膠。通常選用孔徑小、排阻極限小的凝膠。由于凝膠層析介質的孔隙小,鹽等小分子可以擴散進入凝膠顆粒內部,而大分子不能擴散進入,沿液體的流動方向從柱中流出,達到分離的目的。

對于分級分離,凝膠的選擇非常重要,因為被分離物質的分子量接近,要根據被分離物質的分子量及各種凝膠的選擇性特性曲線進行選擇。一般先選擇排阻極限較低的凝膠,這類介質由于孔徑小,珠體的剛性較強,流速可以有較大的選擇范圍,有利于操作,使被分離物質的洗脫較快,且活性物質的活性回收率較高。若是在水溶液中操作,則選擇親水性的介質;若是在疏水性的有機溶劑中進行分離,則必須選用疏水性的介質。

2.2 型號的選擇:

在組族分離時,凝集介質的選擇比較容易,因為要分離的兩類組分在分子量上又很大的差異,因而容易進行完全地分辨。應選擇分子量在排阻極限以上的凝膠介質,是大分子量的物質不擴散進入凝膠內部,在外水體積時洗脫,這樣區帶的擴散和稀釋程度最小,并能減少目標產物留在柱上的時間。脫鹽工藝中常選用中等粒徑的葡聚糖凝膠。相對分子質量低至5000的目標產物組分需要脫鹽時,都可以選用它。這類凝膠介質具有較好的剛性、優良的通透性及較好的流速。

對于分級分離而言,選擇凝膠介質是一項重要的工作,因為需要分離的物質是一系列分子量接近的成分。選擇時需要考慮被分離物質的分子量與凝膠介質的選擇性曲線,即必須考慮凝膠介質的分離范圍,如果凝膠介質選擇不當,會使幾種被分離的物質幾乎同時從柱中流出,或可以同時在凝膠介質的孔中擴散,而得到的分離譜圖的洗脫峰都在外水峰中,或洗脫峰重疊,達不到分離的目的。

如果在分離中需要使用解離劑或洗滌劑時,凝膠介質的選擇更應注意,要考慮到它們對被分離分子的構型所產生的影響。因為用一些洗滌劑作為助溶劑對一些水溶性較低的膜蛋白組分尤為合適,但對蛋白質的構型有一定的影響,因此要選用孔徑更大一些的凝膠介質較為合適。

由于各種凝膠介質的分類范圍有時會部分重疊,對一些目標產物可選用的分離介質也可能不止一種。這時通??蛇x擇排阻極限較低的凝膠介質,以使目標產物洗脫較快,還有可能提高目標產物的活性回收。此外,對于化學結構相同的凝膠介質,低排阻極限者往往有更佳的剛性,應用時可在較大的范圍內選擇流速,有利于生產效率的提高。

2.3 粒徑的選擇:

介質的粒徑要根據具體的實驗情況而選擇,尤其要根據分類對象及要求達到的目的而選擇。粒徑較小的分離介質,顆粒在柱內易于分布均勻,形成的層析帶擴散較小,分辨率高,但流速較慢,主要用于分辨率要求較高的分級分離,適用于分析層析、小柱操作、少量樣品的精制及分子量的測定等。粒徑較大的分離介質,柱的通透性好,流速較快,適宜于處理大量的工作液,如脫鹽或分子量較大的物質之間的分離,因而在規模生產中,多選用粒徑較大的介質。但無論選擇哪種類型的分類,都要求介質具有較窄的粒徑分布,因為粒徑分布越均勻,柱的分辨率就越高,越易得到理想的分離效果。

3. 凝膠層析柱的選擇

3.1 柱結構的選擇:

為了獲得最佳的凝膠層析效果,應注意柱體設備的選用。層析柱是凝膠層析技術中的主要部件,一般用玻璃管或有機玻璃管。在柱的下部應有孔徑分布均勻的篩板,以利于流動相均勻地流出,防止柱內液體的偏流。在層析柱的濾板下,死體積應盡量地小,如果支撐濾板下的死體積大,則被分離組分之間重新混合的可能性就大,其結果將影響洗脫峰形,出現拖尾現象,降低分辨率。在精確分離時,死體積不能超過床體積的千分之一。

在選用層析柱的材質及柱體時,還必須考慮柱的耐壓及耐溶劑性。柱體及各連接部件都必須選用耐酸堿及耐有機溶劑的材質,以利于延長層析柱的使用壽命,并可避免對分離物的污染。

3.2 柱內徑的選擇:

雖然層析柱直徑的大小不影響分離度,但也要選用內徑合適的柱體。較細的柱體有時會產生管壁效應,而直徑過大,則稀釋將成為一項不利的因素。柱體的直徑應根據分離物的量來選用,在加樣時應將樣品均勻地分布于凝膠層析柱的床面上。制備用的凝膠層析柱,直徑一般大于2cm,樣品量較大時,可加大柱的直徑。柱的直徑加大后,洗脫液的體積將增大,樣品的稀釋度也將加大。

3.3 柱長度的選擇:

凝膠層析中兩個被分離區帶的分離度取決于柱的高度,為分離不同的組分,層析柱必須有合適的高度,分辨率與柱體長度的平方根而成正比。因此適宜選用較長的柱體,尤其是分級分離,以便于獲得最佳的分辨率。但對于某些基質較軟的凝膠介質,若床柱過高,珠體受擠壓會發生變形,影響流速,所以一般應不超過1米。通常在進行組族分離時,層析柱的長度大多在2~30cm之間,在進行分級分離時,層析柱的長度需要100cm左右。層析柱的直徑一般在1~5cm之間,小于1cm易產生管壁效應,大于5cm則稀釋現象嚴重。層析柱的長度與直徑的比值一般宜在7~10之間,但對移動慢的物質,宜在30~40之間。對于分離精度要求較高的工藝,也可采用層析柱串聯的方法,可以提高層析柱的分辨率。

選擇層析柱的一般原則是,柱的長度取決于工藝所要求的分辨率,而柱的內徑則取決于被分離樣品的量。在進行脫鹽時,將所需體積的凝膠介質充裝在短而粗的柱體內,是最佳的脫鹽系統,這樣可以取得較大的體積流速,提高脫鹽的速度,減少對樣品的稀釋。而不宜選用長而細的柱體。

4. 凝膠層析操作中應注意的事項

4.1 凝膠層析介質的溶脹、裝柱:

商品凝膠層析介質有的為干燥顆粒,使用前先進行水合膨脹,也可直接在洗脫液中進行溶脹。溶脹必須徹底,否則影響層析的均一性,甚至會有層析柱脹裂的危險。將凝膠介質顆粒直接放入水或洗脫液中,攪拌均勻,在室溫下經過10小時左右即可得到較充分的溶脹。為了加速溶脹,也可進行加熱,即在沸水浴中將濕的凝膠漿逐漸升溫接近沸騰,這樣可大大加速溶脹的速度,約1~2小時即可達到平衡。加熱溶脹不但可以節省時間,還可消毒,除去凝膠介質中的污染物和排除凝膠內的氣泡。

凝膠層析介質充分溶脹后即可進行裝柱。層析柱安裝時要保證垂直,一般用泵將凝膠漿打入柱中。目前無論實驗室或規模生產,都可以采用裝柱機進行裝柱,這樣可使柱內的介質分布均勻,而且裝柱的速度也很快。如果是人工裝柱,應將攪拌均勻的凝膠介質一次性倒入柱中,不能產生分層現象。裝柱后必須檢驗柱中介質是否分布均勻,有無“紋路”或氣泡,這樣才能保證層析正常工作。在凝膠層析操作中,裝柱是影響分離效果的一個重要步驟,為確保裝柱效果,在裝柱后可用1%的丙酮進行柱效測定,測定其理論塔板數。

4.2 柱的重復使用及保存:

凝膠層析介質不會與被分離物質發生任何作用,因而在層析分離后,只要稍加平衡就能進行下一周期的工作,這是凝膠層析介質的優點之一。因此凝膠層析介質在裝柱后可以反復使用,不必特殊處理,而不影響分離效果。瓊脂糖系列的介質,一般是以濕態出售,并保存在乙醇溶液中,因此在使用前應先用大量的純水洗去乙醇后再進行分離工序。

在實際操作中,常有一些雜質污染凝膠介質或層析床的表面,因此必須進行適當的處理,清除這些“污染物”。應根據污染的情況來決定處理的時間。一般情況下,輕微污染可以忽略,繼續使用。當層析介質顏色發生明顯變化,甚至層析柱表面出現沉淀物,使表面有明顯板結時,則必須進行處理。除對樣品進行預處理外,對層析柱也要進行凈化處理。如果沉淀物與溫度有關,可以用溫水或適當的緩沖液進行洗滌,使沉淀溶解、去除。如果難以溶解,就必須將嚴重污染的表層介質挖掉,并添加新的層析介質。被污染的層析柱,可用0.2mol/L的NaOH和0.5mol/L的NaCl混合溶液進行處理。這種方法,通??上吹粢恍┪廴疚?。

如果污染嚴重,或層析柱經過若干次使用后,出現介質的色澤改變,流速降低,表面有污染物等情況時,必須采用適當的方法進行處理,恢復其原來的性質和功能,這就是所謂的再生。對于多糖類的介質,可采用溫熱的0.5mol/L  NaOH和0.5mol/L  NaCl混合溶液緩慢通過層析柱,甚至可以浸泡一段時間,以清除污染物,恢復層析柱的功能。

經常使用的層析柱以濕態保存為好,只要在其中加入合適的防腐劑就可以防止幾個月甚至一年,并不需要將介質干燥。特別是瓊脂糖介質,不但干燥操作繁雜,而且干燥后不易溶脹,因此一般都以濕態保存。為了防止凝膠層析介質中滋長細菌,可將其保存在20%的乙醇溶液中,或堿性溶液中。尤其是乙醇溶液浸泡,已成為目前通用的保存方法。

4.3 對分離樣品的要求:

待分離的樣品必須無沉淀,且粘度不可太大,否則將影響分離的效果。因此在進行層析之前,樣品應進行預處理,除去其中的不溶性雜質,若能經過超濾等方式除去其中的膠體物質,不但可提高分離效果,還利于延長層析柱的使用壽命。

根據分離模式的不同,上樣量略有差別,分析性分離及分級分離都需要最大的分辨率,與柱長相比,要求起始區帶的寬度應非常狹窄。此時樣品體積最好是柱體積的1%~5%。即使再減小樣品的上樣量,一般也不能再提高分辨率。對于組族分離及某些分級分離的實驗中,峰的分離良好,通過實驗設計可以增加樣品量,一般樣品液量可達凝膠層析床體積的10%。在蛋白質溶液除鹽時,有時樣品量也可高達凝膠層析床體積的20%~30%。上樣量適宜,洗脫出的峰形才能較好,才能提高分辨率。在規模生產中,為了提高生產效率,在能保障產品純度的情況下,可盡量加大樣品的用量。

樣品的粘度也是影響上樣量和層析柱分離效果的因素之一。粘度往往限制了所能采用的最高濃度用量。樣品濃度過高,使區帶不穩定,流速也不規則,這樣會使峰帶嚴重擴寬和扭曲,影響分離效果和上樣量。此時應使用適當的緩沖液降低樣品的粘度。

凝膠層析常作為下游的最終精細純化步驟,通常與其它的工藝或其它的柱層析聯合使用,例如肽、多糖、酶、重組蛋白、抗體及大蛋白等,樣品已經過初步純化、濃縮,選用適當的上樣量,可以得到滿意的分離效果。

4.4 洗脫劑的選用:

在凝膠層析中,洗脫劑往往不直接影響分辨率。對于完全不帶電荷的物質,可用蒸餾水進行洗脫,帶電荷物質的凝膠層析,可用適合的緩沖液進行洗脫,以控制pH值。對于多糖類的分離介質,緩沖液的離子強度至少應為0.02mol/L。對于聚丙烯酰胺類的凝膠介質,離子強度為0.05mol/L。使用一定離子濃度的緩沖液,其目的是防止被分離物質與凝膠介質骨架間的離子相互作用。有時在凝膠介質的分級分離中,為避免生物大分子與凝膠介質產生非特異性吸附,甚至可在緩沖液中加入0.1~0.2mol/L的NaCl。

5. 流速的選擇:

一般情況下,增加流速往往會使分辨率下降,在使用長柱和低流速時,可以取得最大的分辨率,使用短柱和高流速時可以得到快速的分離。由此可見,良好的分辨率和分離時間是相互矛盾的。由于分離的物質不同,柱的結構不同,必須根據所要求的分辨率進行實驗,確定最佳的流速以得到滿意的分離效果。

綜上所述,凝膠層析工藝參數對分離純化的效果有明顯的影響,不但凝膠層析介質種類的選擇有重要影響,其它各工藝參數,如柱的高徑比、流速、介質的床高等因素都影響分離效果。而參數的確立,要根據待分離的物質及所要求的純度,通過實驗而確定。

 

  
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