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離子交換層析介質的應用

 

離子交換層析分離純化生物大分子的過程,主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進行選擇分離的?,F已成為分離純化生化制品、蛋白質、多肽等物質中使用最頻繁的純化技術之一。

1. 離子交換劑的選擇

在進行分離純化時,要求層析柱具有高負載量、易于操作及使用壽命長等特點,其中分離介質是最主要的影響因素,因此,分離介質的選擇尤為重要。

1.1 品種的選擇:

應根據被分離純化目標產物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學性質及所處的微環境等因素,選擇適宜的離子交換層析介質。對于無機小分子而言,分離介質的選擇相對容易,但對于生物大分子就必須考慮更多的因素。

蛋白質等生物大分子是由多種氨基酸所組成的,在不同的pH條件下顯示不同的電性,而生物大分子對最適宜的pH環境具有特定的要求,因此,必須首先了解目標蛋白的等電點及適宜的微環境,根據這些條件選擇合適的離子交換劑種類。

是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑,主要取決于被分離的物質在其穩定的pH 下所帶的電荷,如果帶正電,則選擇陽離子交換劑;如帶負電,則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4,穩定的pH 范圍為6~9,由于這時蛋白帶負電,故應選擇陰離子交換劑進行分離。

1.2 骨架的選擇:

應根據目標產品的產量、要求達到的純度及經濟價值等因素,選擇合適骨架(基質)的離子交換劑。

通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結構穩定、價格低廉、全交換容量高等特點,適用于如抗生素、有機酸、動物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產品,仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質的生化分離專用介質。

纖維素離子交換劑價格較低,但分辨率和穩定性都較低,適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中,但受外界影響較大,體積可能隨離子強度和pH 變化有較大改變,影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩定性較好,分辨率也較高,但價格較貴。

理想的分離介質應該不但易于吸附,還要易于洗脫,如果目標產物對于離子強度和pH值的變化不敏感,可以考慮采用高電荷密度的強酸性或強堿性的強型介質。如果對這些因素比較敏感,則應采用弱酸性或弱堿性的弱型介質。如果大分子物質被吸附后,結合比較牢固,往往難以洗脫,采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性,則應選用功能基團密度低的介質。

強酸性或強堿性的強型介質,適用的pH 范圍廣,常用于分離一些小分子物質或在極端pH 下的分離,但由于電性較強,有時易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質,其選擇性有較大的范圍,且不易使蛋白質失活,故一般適用于分離蛋白質等大分子物質,但其適用的pH范圍較窄。

1.3 粒徑的選擇:

分離介質粒徑的大小對離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質的粒徑小,分辨率高,但平衡離子的平衡時間長,流速慢;粒徑大則柱的流速較快,壓降小,但分辨率低,負載量也較小。所以大顆粒的分離介質適合于對分辨率要求不高的大規模制備性分離,而小顆粒的分離介質適合于需要高分辨率的精細分離或產品的精制階段。

2. 操作中注意事項

2.1 預處理:

在離子交換劑的工業產品中,常含有少量的有機低聚物及一些無機雜質,在使用初期會逐漸溶解釋放,影響目標產品的質量。因此,工業級離子交換劑在使用前必須進行預處理。

通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進行處理,可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液,以4~6倍樹脂床體積交替進行處理,在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對于大孔型的樹脂,還需要用乙醇、丙酮等有機溶劑進行處理,以除去生產過程中所用的有機物殘余物。對分離介質進行預處理,不但能提高其工作容量,更可提高被分離產品的純度。經預處理后的樹脂,最后應轉為分離過程中適用的離子型態。

對于生化專用的離子交換劑,以多糖類骨架為主的介質,一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質在分離過程中盡量減少pH值的變化,需要用大量的去離子水進行清洗,然后用緩沖液進行平衡。

分離介質的預處理可以在柱內進行,也可以在燒杯等容器中進行。在柱內進行預處理時,或溶液體系改變及操作溫度變化時,經常會出現氣泡,尤其在使用內徑較小的柱時。氣泡一經出現,必須及時清除,否則對層析工藝有明顯的影響。

2.2 緩沖液平衡介質:

pH值是離子交換層析的操作中的一個重要因素,而pH的穩定及改變通常是用緩沖液來實現的,所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。

在選擇緩沖液時,pH和離子強度是兩個關鍵性的因素,它不僅影響到分離介質對目標產物與雜質的分離效果,而且還影響到產品的收率。選用的pH值取決于目標產物的等電點、穩定性和溶解度,不但要使被分離的物質成為可以進行交換的離子,還要維持其較高的活性。同時也應該考慮到離子交換劑的pK值。

由于緩沖液本身帶電,所以也會與離子交換層析介質結合。這種結合將帶來兩方面的干擾,一方面降低緩沖液的濃度,進而降低了緩沖能力;另一方面是與分離介質進行交換,從而與蛋白質競爭介質的交換容量。因此,在使用陰離子交換層析介質時,要避免采用磷酸鹽之類的帶負電的緩沖液,在使用陽離子交換層析介質時,則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質的種類不同,起始過程也略有不同,在通常情況下,使用陰離子交換層析介質時,起始緩沖液要高于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值;使用陽離子交換層析介質時,則起始緩沖液要低于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值。

2.3 層析柱的操作:

2.3.1 操作方式:

由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動相,可在流經柱時進行分離,因此,離子交換可以采用柱式操作,以層析形式進行分離。在分離過程中,未被吸附的物質不斷流出反應體系,使平衡不斷右移,是一種動態平衡,所以也稱為動態操作。動態操作方式分離效果好,適用于各類樣品,可實現連續操作。在層析分離的操作中,層析柱的裝填情況對分離有一定的影響,介質在柱內要分布均勻,尤其不允許氣泡的存在,也應防止介質產生分層現象。

對于一些粘度較大的樣品,進行初步提取分離時,也可以采用“靜態”處理方法,經離子交換劑與需處理的工作液在反應容器中進行攪拌,當達到吸附平衡后,將介質與殘液分離,裝入柱中進行洗脫。這種靜態分批操作的方法,工藝設備簡單,操作簡便,如肝素鈉等一些天然產物的初步分離,往往采用這種靜態分離方式。在靜態分離方式的操作中,應適當控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度,若攪拌速度過快,剪切力過大,會造成離子交換顆粒的破碎,難以進行過濾分離;但若攪拌速度過慢,則影響介質與工作液的接觸,也影響交換速率。

2.3.2 柱式操作的種類:

固定床分離:在柱式操作中,料液作為流動相,在柱內自上而下地流動,在流動的過程中進行吸附。為了得到較好的分離效果,對分離柱有三點最基本的要求:分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板,以防止流動相產生偏流;分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小,以防止分離過程中色譜帶混合或擴展;無論大小,分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中,可以進行正向洗脫,也可以進行逆向洗脫,一般情況下,逆向洗脫或再生可獲得較好的效果,但對操作有較為嚴格的要求。

流態床:流動的料液從柱的下端流入,從上端流出,分離介質在柱內呈流態狀。此種分離方法對操作有嚴格的要求,一般較少應用,洗脫方式以采用正向洗脫為好。

2.3.3 工作液對分離效果的影響:

為了使生化分離達到高分辨率及高負載量,工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果,還影響到分離介質的使用壽命。生化分離往往是一個比較復雜的體系,其中有多種雜質存在,不但有簡單的小分子,還有一些膠體物質、脂類物質等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質的功能基團,或堵塞了介質的孔道,造成不可逆污染,縮短分離介質的使用壽命。因此,在分離操作前,應盡量將工作液進行適當的預處理,以確保分離的效果。

在生化分離純化過程中,由于淋洗過程帶走了一些目標產物,或因洗脫不完全而使目標產物滯留在介質上,造成產物的損失,是影響產品收率的重要因素,同時,蛋白質的結構變化引起失活,也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩定劑或保護劑,不但可以提高收率,還可提高分離介質對蛋白質的選擇性。

2.3.4 流速對分離效果的影響:

離子交換層析分離中,流速是影響分離效果的一個重要因素。為了獲取優良的分離效果,應根據離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結構等因素,進行試驗,以確立較佳的試驗參數。若目標產物的分子量相對比較小,且介質的孔徑比較大時,因為有利于傳質作用,可采用較高的流速。而對于目標產物為生物大分子,且介質的孔徑相對于被分離物質分子較小時,由于分子的擴散速率較慢,則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時,因傳質速率較低,也應采用較低的流速。

流速不但影響交換吸附的效果,也影響洗脫的效果,通常情況下,洗脫時的流速要比交換吸附時慢些。

2.4 介質的洗脫、再生方式:

當離子交換劑失效后,應進行洗脫,其基本原理是用一種比吸著物質更活潑的離子或基團,把交換吸附到介質顆粒外表面和內部的目標產物解吸下來。吸著物不同,其活潑性不同,因此,應選擇合適的洗脫劑,將蛋白質從介質上洗脫下來,收集分離純化的產物。

離子交換層析大致有三種洗脫方式:

一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質,可采用稀的酸、堿或鹽類溶液,也可選用適當的有機溶劑,其中以鹽溶液為主,依據目標產物的性質及最終得到產物的劑型進行選擇。由于被吸著的物質往往不是單一的品種,各種物質所帶的電荷電量不同,與介質的結合強度不同,即使使用同一種洗脫劑,容易被替換的物質先脫離介質流出,結合力較強的物質后流出,只要通過分級收集,就可以把各種物質分離,得到較純凈的產物。這種方法多用于對目標產物的性能了解很清楚時的分離,或用于分析類的分離。

第二種為分步洗脫,即分別用不同濃度的鹽溶液進行洗脫。分離介質在交換吸附過程中,會有多種蛋白質被吸附,如果采用一個恒定的洗脫條件,有時不能將所有的組分適當地分開,需要改變洗脫條件??梢允请A段式的改變,即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進行洗脫,可以根據洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標蛋白,不同的鹽濃度可以得到不同的目標蛋白。這種分步洗脫的方式,適用于已知性質蛋白的分離,尤其適用于規模生產中,操作方便,易于控制。

第三種為連續的梯度洗脫,即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強度或pH值(一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式),在洗脫劑漸變的過程中,將不同的蛋白質逐一置換,可得到各種不同的蛋白組分,同時,蛋白質一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式,也是洗脫能力相對最強的洗脫方式,適合于對電荷性質相近組分的洗脫。

在洗脫過程中,順流洗脫或逆流洗脫均可采用,順流洗脫也稱為正向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相同,逆流洗脫也稱為反向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進行交換吸附的,則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高,洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復雜得多,故目前多以正向洗脫為主。

洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離的效果,洗脫速度通常要保持恒定。一般來說,慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好,但洗脫速度過慢,會造成分離時間長,樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用,所以要根據實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中于某個區域造成重疊,則應適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好,但洗脫峰過寬,則應適當提高洗脫速度。

2.5 介質的消毒:

在某些純度要求較高的生化產品制備過程中,往往要求對分離介質進行消毒處理,以防止微生物等雜質混入目標產品中。

采用高溫消毒是最常用的方法,目前大多數離子交換劑具有穩定的物理化學性能,均可進行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質時,必須注意,介質一定要處于鹽型,而且要在中性條件下才能進行高溫消毒處理,否則將會導致多糖大分子骨架的降解,嚴重影響介質的使用壽命。

NaOH也是一種很好的消毒劑,但要根據介質的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內浸泡法,即將一定濃度的NaOH通入柱中,關閉出液閥,浸泡幾個小時后,可達到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。

2.6 介質的“復蘇”:

在生化分離過程中,由于分離體系較為復雜,含有多種蛋白質或其他雜質,因此在使用過程中常出現樹脂的“中毒”現象。中毒原因可能是由于大分子的多點帶電,與介質進行多點結合,致使難以洗脫,使介質的有效功能基團減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內,難以擴散出來,堵塞了孔道,在以后的交換過程中影響到顆粒內功能基團的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介質中毒。有時工作液中的膠狀物質被粘附于介質顆粒的內外表面,覆蓋了功能基團,這也是影響介質工作容量的重要因素。

由于上述原因,離子交換層析介質在使用一段時間后,可能出現顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質收率降低、反壓升高等現象。此時,需要對介質進行凈化處理。對于介質用量比較大,自動化程度比較高的規模生產,應采用在原交換柱內進行,即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水,目的是去除交換柱中的懸浮物,并將床體疏松,還可以將結塊的介質分散,有利于以后介質與清洗液的接觸。對于一般的污染,采用逆流清洗,可減少污染物對下層介質的污染。應根據介質種類及污染程度的不同,分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡,各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經過上述處理后仍無明顯改善,尤其是流速無明顯提高,則要檢查交換柱布水器的紗網是否出現堵塞。

上述過程即為通常所說的“復蘇”過程。不同的介質應選用不同的復蘇方法,主要取決于介質的物理化學性能及污染物質的性質。對于多糖類的離子交換劑,每當使用一段時間后,可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質,因為緩沖液的離子強度較大時,有利于蛋白質大分子脫離介質,達到復蘇的效果。對于物化結構穩定的介質,也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質。對于物化結構非常穩定的介質,可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進行洗脫或浸泡,在高溫下可使吸附在介質上的蛋白變性或加快擴散速度,也有利于膠體物質的破壞,從而使污染物脫離介質。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介質的復蘇。

清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白,處理步驟更為復雜??刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后,都要用至少2倍體積的蒸餾水進行清洗。使用有機溶劑后,交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進行清洗,即可以在5倍床體積內,使溶劑的含量從0增至100%,然后在下一個5倍床體積中,使溶劑的含量從100%降到0。

如果經過上述處理,交換柱的工作情況仍沒有恢復,可以使用蛋白水解酶,將仍滯留在介質內的蛋白質進行水解,使其脫離介質??梢圆捎煤?mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中,在室溫下浸泡過夜,或在37℃下浸泡一小時。根據污染物的情況,也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后,都要重復上述清除污染物的清洗步驟,把酶清洗干凈。

脂蛋白對分離介質的污染比較嚴重,因為脂蛋白及其它脂類物質,很容易粘附在層析柱內,最好在進行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑,可去除高含量的脂蛋白。

2.6 介質的貯存:

各種分離介質在使用后都要進行清洗后再貯存,這對于多糖類分離介質尤為重要。分離介質在使用后,先用2個床體積的清水清洗,然后用2個床體積的20%的乙醇過柱。對于SP強酸性陽離子介質,要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗,再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經過處理后,可在室溫下貯存,或在4~8℃下長期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉,以防止水分的揮發,造成干柱。暫時不用的介質必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質,都要在4℃~30℃的條件下貯存,并防止冷凍。

離子交換層析分離純化生物大分子的過程,主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進行選擇分離的?,F已成為分離純化生化制品、蛋白質、多肽等物質中使用最頻繁的純化技術之一。

1. 離子交換劑的選擇

在進行分離純化時,要求層析柱具有高負載量、易于操作及使用壽命長等特點,其中分離介質是最主要的影響因素,因此,分離介質的選擇尤為重要。

1.1 品種的選擇:

應根據被分離純化目標產物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學性質及所處的微環境等因素,選擇適宜的離子交換層析介質。對于無機小分子而言,分離介質的選擇相對容易,但對于生物大分子就必須考慮更多的因素。

蛋白質等生物大分子是由多種氨基酸所組成的,在不同的pH條件下顯示不同的電性,而生物大分子對最適宜的pH環境具有特定的要求,因此,必須首先了解目標蛋白的等電點及適宜的微環境,根據這些條件選擇合適的離子交換劑種類。

是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑,主要取決于被分離的物質在其穩定的pH 下所帶的電荷,如果帶正電,則選擇陽離子交換劑;如帶負電,則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4,穩定的pH 范圍為6~9,由于這時蛋白帶負電,故應選擇陰離子交換劑進行分離。

1.2 骨架的選擇:

應根據目標產品的產量、要求達到的純度及經濟價值等因素,選擇合適骨架(基質)的離子交換劑。

通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結構穩定、價格低廉、全交換容量高等特點,適用于如抗生素、有機酸、動物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產品,仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質的生化分離專用介質。

纖維素離子交換劑價格較低,但分辨率和穩定性都較低,適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中,但受外界影響較大,體積可能隨離子強度和pH 變化有較大改變,影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩定性較好,分辨率也較高,但價格較貴。

理想的分離介質應該不但易于吸附,還要易于洗脫,如果目標產物對于離子強度和pH值的變化不敏感,可以考慮采用高電荷密度的強酸性或強堿性的強型介質。如果對這些因素比較敏感,則應采用弱酸性或弱堿性的弱型介質。如果大分子物質被吸附后,結合比較牢固,往往難以洗脫,采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性,則應選用功能基團密度低的介質。

強酸性或強堿性的強型介質,適用的pH 范圍廣,常用于分離一些小分子物質或在極端pH 下的分離,但由于電性較強,有時易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質,其選擇性有較大的范圍,且不易使蛋白質失活,故一般適用于分離蛋白質等大分子物質,但其適用的pH范圍較窄。

1.3 粒徑的選擇:

分離介質粒徑的大小對離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質的粒徑小,分辨率高,但平衡離子的平衡時間長,流速慢;粒徑大則柱的流速較快,壓降小,但分辨率低,負載量也較小。所以大顆粒的分離介質適合于對分辨率要求不高的大規模制備性分離,而小顆粒的分離介質適合于需要高分辨率的精細分離或產品的精制階段。

2. 操作中注意事項

2.1 預處理:

在離子交換劑的工業產品中,常含有少量的有機低聚物及一些無機雜質,在使用初期會逐漸溶解釋放,影響目標產品的質量。因此,工業級離子交換劑在使用前必須進行預處理。

通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進行處理,可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液,以4~6倍樹脂床體積交替進行處理,在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對于大孔型的樹脂,還需要用乙醇、丙酮等有機溶劑進行處理,以除去生產過程中所用的有機物殘余物。對分離介質進行預處理,不但能提高其工作容量,更可提高被分離產品的純度。經預處理后的樹脂,最后應轉為分離過程中適用的離子型態。

對于生化專用的離子交換劑,以多糖類骨架為主的介質,一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質在分離過程中盡量減少pH值的變化,需要用大量的去離子水進行清洗,然后用緩沖液進行平衡。

分離介質的預處理可以在柱內進行,也可以在燒杯等容器中進行。在柱內進行預處理時,或溶液體系改變及操作溫度變化時,經常會出現氣泡,尤其在使用內徑較小的柱時。氣泡一經出現,必須及時清除,否則對層析工藝有明顯的影響。

2.2 緩沖液平衡介質:

pH值是離子交換層析的操作中的一個重要因素,而pH的穩定及改變通常是用緩沖液來實現的,所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。

在選擇緩沖液時,pH和離子強度是兩個關鍵性的因素,它不僅影響到分離介質對目標產物與雜質的分離效果,而且還影響到產品的收率。選用的pH值取決于目標產物的等電點、穩定性和溶解度,不但要使被分離的物質成為可以進行交換的離子,還要維持其較高的活性。同時也應該考慮到離子交換劑的pK值。

由于緩沖液本身帶電,所以也會與離子交換層析介質結合。這種結合將帶來兩方面的干擾,一方面降低緩沖液的濃度,進而降低了緩沖能力;另一方面是與分離介質進行交換,從而與蛋白質競爭介質的交換容量。因此,在使用陰離子交換層析介質時,要避免采用磷酸鹽之類的帶負電的緩沖液,在使用陽離子交換層析介質時,則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質的種類不同,起始過程也略有不同,在通常情況下,使用陰離子交換層析介質時,起始緩沖液要高于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值;使用陽離子交換層析介質時,則起始緩沖液要低于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值。

2.3 層析柱的操作:

2.3.1 操作方式:

由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動相,可在流經柱時進行分離,因此,離子交換可以采用柱式操作,以層析形式進行分離。在分離過程中,未被吸附的物質不斷流出反應體系,使平衡不斷右移,是一種動態平衡,所以也稱為動態操作。動態操作方式分離效果好,適用于各類樣品,可實現連續操作。在層析分離的操作中,層析柱的裝填情況對分離有一定的影響,介質在柱內要分布均勻,尤其不允許氣泡的存在,也應防止介質產生分層現象。

對于一些粘度較大的樣品,進行初步提取分離時,也可以采用“靜態”處理方法,經離子交換劑與需處理的工作液在反應容器中進行攪拌,當達到吸附平衡后,將介質與殘液分離,裝入柱中進行洗脫。這種靜態分批操作的方法,工藝設備簡單,操作簡便,如肝素鈉等一些天然產物的初步分離,往往采用這種靜態分離方式。在靜態分離方式的操作中,應適當控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度,若攪拌速度過快,剪切力過大,會造成離子交換顆粒的破碎,難以進行過濾分離;但若攪拌速度過慢,則影響介質與工作液的接觸,也影響交換速率。

2.3.2 柱式操作的種類:

固定床分離:在柱式操作中,料液作為流動相,在柱內自上而下地流動,在流動的過程中進行吸附。為了得到較好的分離效果,對分離柱有三點最基本的要求:分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板,以防止流動相產生偏流;分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小,以防止分離過程中色譜帶混合或擴展;無論大小,分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中,可以進行正向洗脫,也可以進行逆向洗脫,一般情況下,逆向洗脫或再生可獲得較好的效果,但對操作有較為嚴格的要求。

流態床:流動的料液從柱的下端流入,從上端流出,分離介質在柱內呈流態狀。此種分離方法對操作有嚴格的要求,一般較少應用,洗脫方式以采用正向洗脫為好。

2.3.3 工作液對分離效果的影響:

為了使生化分離達到高分辨率及高負載量,工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果,還影響到分離介質的使用壽命。生化分離往往是一個比較復雜的體系,其中有多種雜質存在,不但有簡單的小分子,還有一些膠體物質、脂類物質等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質的功能基團,或堵塞了介質的孔道,造成不可逆污染,縮短分離介質的使用壽命。因此,在分離操作前,應盡量將工作液進行適當的預處理,以確保分離的效果。

在生化分離純化過程中,由于淋洗過程帶走了一些目標產物,或因洗脫不完全而使目標產物滯留在介質上,造成產物的損失,是影響產品收率的重要因素,同時,蛋白質的結構變化引起失活,也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩定劑或保護劑,不但可以提高收率,還可提高分離介質對蛋白質的選擇性。

2.3.4 流速對分離效果的影響:

離子交換層析分離中,流速是影響分離效果的一個重要因素。為了獲取優良的分離效果,應根據離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結構等因素,進行試驗,以確立較佳的試驗參數。若目標產物的分子量相對比較小,且介質的孔徑比較大時,因為有利于傳質作用,可采用較高的流速。而對于目標產物為生物大分子,且介質的孔徑相對于被分離物質分子較小時,由于分子的擴散速率較慢,則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時,因傳質速率較低,也應采用較低的流速。

流速不但影響交換吸附的效果,也影響洗脫的效果,通常情況下,洗脫時的流速要比交換吸附時慢些。

2.4 介質的洗脫、再生方式:

當離子交換劑失效后,應進行洗脫,其基本原理是用一種比吸著物質更活潑的離子或基團,把交換吸附到介質顆粒外表面和內部的目標產物解吸下來。吸著物不同,其活潑性不同,因此,應選擇合適的洗脫劑,將蛋白質從介質上洗脫下來,收集分離純化的產物。

離子交換層析大致有三種洗脫方式:

一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質,可采用稀的酸、堿或鹽類溶液,也可選用適當的有機溶劑,其中以鹽溶液為主,依據目標產物的性質及最終得到產物的劑型進行選擇。由于被吸著的物質往往不是單一的品種,各種物質所帶的電荷電量不同,與介質的結合強度不同,即使使用同一種洗脫劑,容易被替換的物質先脫離介質流出,結合力較強的物質后流出,只要通過分級收集,就可以把各種物質分離,得到較純凈的產物。這種方法多用于對目標產物的性能了解很清楚時的分離,或用于分析類的分離。

第二種為分步洗脫,即分別用不同濃度的鹽溶液進行洗脫。分離介質在交換吸附過程中,會有多種蛋白質被吸附,如果采用一個恒定的洗脫條件,有時不能將所有的組分適當地分開,需要改變洗脫條件??梢允请A段式的改變,即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進行洗脫,可以根據洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標蛋白,不同的鹽濃度可以得到不同的目標蛋白。這種分步洗脫的方式,適用于已知性質蛋白的分離,尤其適用于規模生產中,操作方便,易于控制。

第三種為連續的梯度洗脫,即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強度或pH值(一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式),在洗脫劑漸變的過程中,將不同的蛋白質逐一置換,可得到各種不同的蛋白組分,同時,蛋白質一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式,也是洗脫能力相對最強的洗脫方式,適合于對電荷性質相近組分的洗脫。

在洗脫過程中,順流洗脫或逆流洗脫均可采用,順流洗脫也稱為正向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相同,逆流洗脫也稱為反向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進行交換吸附的,則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高,洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復雜得多,故目前多以正向洗脫為主。

洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離的效果,洗脫速度通常要保持恒定。一般來說,慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好,但洗脫速度過慢,會造成分離時間長,樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用,所以要根據實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中于某個區域造成重疊,則應適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好,但洗脫峰過寬,則應適當提高洗脫速度。

2.5 介質的消毒:

在某些純度要求較高的生化產品制備過程中,往往要求對分離介質進行消毒處理,以防止微生物等雜質混入目標產品中。

采用高溫消毒是最常用的方法,目前大多數離子交換劑具有穩定的物理化學性能,均可進行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質時,必須注意,介質一定要處于鹽型,而且要在中性條件下才能進行高溫消毒處理,否則將會導致多糖大分子骨架的降解,嚴重影響介質的使用壽命。

NaOH也是一種很好的消毒劑,但要根據介質的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內浸泡法,即將一定濃度的NaOH通入柱中,關閉出液閥,浸泡幾個小時后,可達到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。

2.6 介質的“復蘇”:

在生化分離過程中,由于分離體系較為復雜,含有多種蛋白質或其他雜質,因此在使用過程中常出現樹脂的“中毒”現象。中毒原因可能是由于大分子的多點帶電,與介質進行多點結合,致使難以洗脫,使介質的有效功能基團減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內,難以擴散出來,堵塞了孔道,在以后的交換過程中影響到顆粒內功能基團的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介質中毒。有時工作液中的膠狀物質被粘附于介質顆粒的內外表面,覆蓋了功能基團,這也是影響介質工作容量的重要因素。

由于上述原因,離子交換層析介質在使用一段時間后,可能出現顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質收率降低、反壓升高等現象。此時,需要對介質進行凈化處理。對于介質用量比較大,自動化程度比較高的規模生產,應采用在原交換柱內進行,即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水,目的是去除交換柱中的懸浮物,并將床體疏松,還可以將結塊的介質分散,有利于以后介質與清洗液的接觸。對于一般的污染,采用逆流清洗,可減少污染物對下層介質的污染。應根據介質種類及污染程度的不同,分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡,各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經過上述處理后仍無明顯改善,尤其是流速無明顯提高,則要檢查交換柱布水器的紗網是否出現堵塞。

上述過程即為通常所說的“復蘇”過程。不同的介質應選用不同的復蘇方法,主要取決于介質的物理化學性能及污染物質的性質。對于多糖類的離子交換劑,每當使用一段時間后,可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質,因為緩沖液的離子強度較大時,有利于蛋白質大分子脫離介質,達到復蘇的效果。對于物化結構穩定的介質,也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質。對于物化結構非常穩定的介質,可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進行洗脫或浸泡,在高溫下可使吸附在介質上的蛋白變性或加快擴散速度,也有利于膠體物質的破壞,從而使污染物脫離介質。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介質的復蘇。

清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白,處理步驟更為復雜??刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后,都要用至少2倍體積的蒸餾水進行清洗。使用有機溶劑后,交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進行清洗,即可以在5倍床體積內,使溶劑的含量從0增至100%,然后在下一個5倍床體積中,使溶劑的含量從100%降到0。

如果經過上述處理,交換柱的工作情況仍沒有恢復,可以使用蛋白水解酶,將仍滯留在介質內的蛋白質進行水解,使其脫離介質??梢圆捎煤?mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中,在室溫下浸泡過夜,或在37℃下浸泡一小時。根據污染物的情況,也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后,都要重復上述清除污染物的清洗步驟,把酶清洗干凈。

脂蛋白對分離介質的污染比較嚴重,因為脂蛋白及其它脂類物質,很容易粘附在層析柱內,最好在進行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑,可去除高含量的脂蛋白。

2.6 介質的貯存:

各種分離介質在使用后都要進行清洗后再貯存,這對于多糖類分離介質尤為重要。分離介質在使用后,先用2個床體積的清水清洗,然后用2個床體積的20%的乙醇過柱。對于SP強酸性陽離子介質,要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗,再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經過處理后,可在室溫下貯存,或在4~8℃下長期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉,以防止水分的揮發,造成干柱。暫時不用的介質必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質,都要在4℃~30℃的條件下貯存,并防止冷凍。

 

  
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