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離子交換層析

 

離子交換層析(Ion Exchange Chromatography 簡稱為IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析是目前生物化學領域中常用的一種層析方法,廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

1. 離子交換層析的基本原理:
離子交換層析是通過帶電的溶質分子與離子交換層析介質中可交換離子進行交換而達到分離純化的方法,也可以認為是蛋白質分子中帶電的氨基酸與帶相反電荷的介質的骨架相互作用而達到分離純化的方法。

離子交換層析法主要依賴電荷間的相互作用,利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離,具有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的,都可使其帶電,所以離子交換層析法已廣泛用于生物大分子的分離、中等純化及精制的各個步驟中。

由于離子交換層析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在醫藥、化工、食品等領域成為獨立的操作單元,也已成為蛋白質、多肽、核酸及大部分發酵產物分離純化的一種重要的方法。目前,在生化分離中約有75%的工藝采用離子交換層析法。

2. 離子交換層析介質:

離子交換層析的固定相是離子交換劑,它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分:高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合,形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合于電荷基團上的相反離子,它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用,稱為陽離子交換劑;平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用,稱為陰離子交換劑。在一定條件下,溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來,并通過電荷基團結合到固定相上,而平衡離子則進入流動相,這就是離子交換層析的基本置換反應。通過在不同條件下的多次置換反應,就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。

陰離子交換劑的電荷基團帶正電,裝柱平衡后,與緩沖溶液中的帶負電的平衡離子結合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。加樣后,負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應,而結合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結合,隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液,如增加離子強度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強度的增加,洗脫液中的離子可以逐步與結合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換,而將各種負電基團置換出來,隨洗脫液流出。與離子交換劑結合力小的負電基團先被置換出來,而與離子交換劑結合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來,這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結合力從小到大的順序逐步被洗脫下來,從而達到分離目的。

各種離子與離子交換劑上的電荷基團的結合是由靜電力產生的,是一個可逆的過程。結合的強度與很多因素有關,包括離子交換劑的性質、離子本身的性質、離子強度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結合力的差異,并通過改變離子強度、pH 等條件改變各種離子與離子交換劑的結合力而達到分離的目的。離子交換劑的電荷基團對不同的離子有不同的結合力。一般來講,離子價數越高,結合力越大;價數相同時,原子序數越高,結合力越大。如陽離子交換劑對離子的結合力順序為:

Li+ < Na+  K+  Rb+  Cs+; Na+  Ca2+  Al3+  Ti4+

蛋白質等生物大分子通常呈兩性,它們與離子交換劑的結合與它們的性質及pH 有較大關系。以用陽離子交換劑分離蛋白質為例,在一定的pH 條件下,等電點pI < pH 的蛋白帶負電,不能與陽離子交換劑結合;等電點pI > pH 的蛋白帶正電,能與陽離子交換劑結合,一般pI 越大的蛋白與離子交換劑結合力越強。但由于生物樣品的復雜性以及其它因素影響,一般生物大分子與離子交換劑的結合情況較難估計,往往要通過實驗進行摸索。

3. 離子交換層析介質的種類和性質:

3.1 離子交換劑的基質:

離子交換劑的大分子聚合物基質可以由多種材料制成,苯乙烯系離子交換劑是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網狀結構的聚苯乙烯為基質。苯乙烯系離子交換劑機械強度大、流速快。但它與水的親和力較小,具有較強的疏水性,容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質,如無機離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素、球狀纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質的離子交換劑都與水有較強的親和力,適合于分離蛋白質等大分子物質。

3.2 離子交換劑的電荷基團:

根據與基質共價結合的電荷基團的性質,可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑的電荷基團帶負電,可以交換陽離子物質。根據電荷基團的解離度不同,又可以分為強酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區別在于它們電荷基團完全解離的pH 范圍,強酸型離子交換劑在較大的pH 范圍內電荷基團完全解離,而弱酸型完全解離的pH 范圍則較小,如羧甲基在pH小于6時就失去了交換能力。一般結合磺酸基團,如磺酸甲基、磺酸乙基等為強酸型離子交換劑,結合磷酸基團和亞磷酸基團為中等酸型離子交換劑,結合酚羥基或羧基,如羧甲基為弱酸型離子交換劑。一般來講強酸型離子交換劑對H 離子的結合力比Na+離子小,弱酸型離子交換劑對H 離子的結合力比Na+離子大。

陰離子交換劑的電荷基團帶正電,可以交換陰離子物質。同樣根據電荷基團的解離度不同,可以分為強堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結合季胺基團,如季胺乙基為強堿型離子交換劑,結合叔胺、仲胺、伯胺等為中等或弱堿型離子交換劑,如結合二乙基氨基乙基為弱堿型離子交換劑。一般來講強堿型離子交換劑對OH-離子的結合力比Cl-離子小,弱酸型離子交換劑對OH-離子的結合力比Cl-離子大。

3.3 交換容量:

交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量,它反映離子交換劑與溶液中離子進行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量,又稱為總交換容量,它只和離子交換劑本身的性質有關。在實際實驗中關心的是層析柱與樣品中各個待分離組分進行交換時的交換容量,它不僅與所用的離子交換劑有關,還與實驗條件有很大的關系,一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經說明都是指有效交換容量。

影響交換容量的因素很多,主要可以分為兩個方面,一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應盡量能夠讓樣品組分進入,這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品,可以選擇較小孔隙的交換劑,因為小分子可以自由的進入孔隙,而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對于較大分子樣品,可以選擇小顆粒交換劑,因為對于很大的分子,一般不能進入孔隙內部,交換只限于顆粒表面,而小顆粒的離子交換劑表面積大。

另一些影響因素如實驗中的離子強度、pH 值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質。一般pH 對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大,如對于弱酸型離子交換劑在pH 較高時,電荷基團充分解離,交換容量大,而在較低的pH 時,電荷基團不易解離,交換容量小。同時pH 也影響樣品組分的帶電性。尤其對于蛋白質等兩性物質,在離子交換層析中要選擇合適的pH 以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結合。一般來說,離子強度增大,交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫,就是要降低交換容量以將結合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數(mmol/g或mmol/mL)來表示。通??梢杂傻味ǚy定。陽離子交換劑首先用HCl 處理,使其平衡離子為H+。再用水洗至中性,對于強酸型離子交換劑,用NaCl 充分置換出H+,再用標準濃度的NaOH 滴定生成的HCl,就可以計算出離子交換劑的交換容量;對于弱酸型離子交換劑,用一定量的堿將H+充分置換出來,再用酸滴定,計算出離子交換劑消耗的堿量,就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。

對于一些常用于蛋白質分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質的量來表示,一般這種表示方法對于分離蛋白質等生物大分子具有更大的參考價值。實驗前可以參閱相應的產品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。

 

  
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